Nature｜cryo-EM揭示 RSV聚合酶的RNA合成起始机制

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呼吸道合胞病毒（RSV）是一种高度传染性的人类病原体，可引起严重的呼吸道感染¹。RSV聚合酶是一种RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)，它将RNA基因组转录成10个病毒mRNA，并复制全长病毒基因组和反基因组RNA²。RSV聚合酶可识别基因组和反基因组3'端的启动子序列，即前导(Le)和尾互补(TrC)序列³。RSV RNA合成的一个独特特征是RSV聚合酶可以在两个不同的位置启动RNA合成：RNA的复制从Le启动子或TrC启动子的1位开始，mRNA转录从Le启动子3位开始⁴。然而，目前缺乏与RNA启动子结合的RSV聚合酶的结构，这阻碍了对RSV RNA合成机制的理解。

2023 年 12 月 20 日，美国埃默里大学Liang Bo团队Nature上发表题为“Structures of the promoter-bound respiratory syncytial virus polymerase”的研究性论文。该研究通过冷冻电镜单颗粒技术（cryo-EM）解析了RSV聚合酶与基因组及反基因组病毒RNA启动子结合的冷冻电镜结构，结合启动子的RSV聚合酶总体结构与未结合的聚合酶相似。这些结构说明了RSV聚合酶和RNA启动子之间的相互作用，并为在RSV启动子第1和第3位启动RNA合成提供了结构基础，有助于RSV的抗病毒研究。

RSV 的RdRP由多功能大(L)聚合酶蛋白和辅助因子磷酸化蛋白(P)组成：L蛋白由5个结构域组成，其中RdRp、Cap和MT具有酶活性并负责RNA合成；相比之下，P蛋白有三个结构域（图 1a）。作者将大量均匀的全长野生型L和P蛋白在昆虫细胞中共表达，并通过亲和、离子交换和尺寸排除色谱法共纯化（图 1b）。为了解析结构，作者从Le和TrC启动子的3'端选择了10nt长的RNA寡核苷酸，分别命名为Le10和TrC10（图 1c），并解析了RSV聚合酶和Le10与TrC10结合的冷冻电镜结构。结合Le10的RSV聚合酶的冷冻电镜结构揭示了L蛋白的RdRp和Cap结构域以及P蛋白的POD和PCTD结构域的存在。相反，L蛋白的CD、MT、CTD和P 蛋白的PNTD结构域无序且不可见，这与apo-form 聚合酶结构一致（图 1d）。RSV L的RdRp和Cap结构域形成一个“碗”结构，提供足够的空间容纳RNA模板和新合成的RNA产物，而RNA合成的“催化口袋”则位于“碗”内。

图1. RSV聚合酶与RSV基因组先导子(Le10)启动子复合物的冷冻电镜结构

RSV L的RdRp结构域采用传统的右手“手指-手掌-拇指”方式折叠（图 2a）。Le10 RNA启动子与RSV L之间的大多数相互作用发生在“手指”(蓝色)和“外围”(灰色)区域，从而形成了RNA模板进入的复合通道。T4G碱基的氧(O6)与残基K619的氮(NZ)相互作用，T4G碱基的氮(N2)与残基E778的氧(OE1)相互作用。从而可以解释为什么RSV聚合酶更倾向于在+1催化位点上的G来启动RNA合成，因为G是唯一一个含有指向K619的O原子和指向E778的N原子的碱基。T4G碱基还与残基F629形成π -π相互作用，这些残基在NNS RNA病毒的聚合酶中都是保守的（图 2b）。

图2. RSV聚合酶(L-P)与RNA模板Le10相互作用的结构基础

结合TrC10的RSV聚合酶的冷冻电镜结构显示TrC10前2个nt位于催化口袋中，另外6个nt位于模板入口通道中（图3a）。RSV L与TrC10相互作用的残基如图 3b 所示。在启动子结合的RSV聚合酶结构中，Le10和TrC10启动子都倾向于在催化位点+1处的G碱基上进行RNA合成起始。G碱基通过与RSV L残基K619和E778侧链的氢键以及与残基F629的π -π相互作用来稳定（图3c）。

图3. RSV聚合酶与RSV反基因组的尾部互补启动子(TrC10)复合物的冷冻电镜结构

与其他单负链病毒目RNA病毒(包括HMPV、VSV、RABV、PIV5、EBOV和NDV7)的RNA聚合酶结构进行对比后发现，这些RNA聚合酶在L蛋白的RdRp和Cap结构域中具有相似的结构，但在RdRp结构域的支撑螺旋（图 4a）和Cap结构域的priming 和intrusion loop（图 4b,c）上观察到显著差异。为了更好地理解RSV聚合酶的RNA合成起始机制，作者模拟了模板和催化“GDN”基序之间的催化位点- 1和+1上的RNA产物的前2 nt。将RSV聚合酶与VSV和RABV的聚合酶进行比较，可以发现VSV L引物环中的W1167和RABV L引物环中的W1180侧链吲哚基团在催化位点−1平行于RSV RNA产物的第一个核苷酸的碱基。由于W1167 (VSV)和W1180 (RABV)与第一个核苷酸的碱基进行π - π相互作用，因此被认为在RNA合成起始过程中起关键作用。

图4. 不同单负链病毒目的病毒RNA聚合酶的结构比较

结构模型还显示了RSV聚合酶更倾向于在Le10启动子的3位和TrC10启动子的1位启动RNA合成（图 5a,c）。虽然Le10结合的复合物在催化孔中比TrC结合的复合物多两个核苷酸，但它们共享8个nt，其中6个nt位于模板入口通道中，2个nt位于催化孔中（图5b,d）。此外还可以观察到在两种启动子结合结构中，RNA残基在催化位点+2和+5处发生扭曲。

图5. RSV聚合酶(L-P)在3位和1位起始状态的模型

综上所述，该研究首次解析了RSV聚合酶与启动子RNA的复合物结构，阐明了RNA启动子如何与聚合酶中的RdRP和Cap结构域相互作用。这些发现提供了RNA合成过程的机制，有助于开发针对RSV和其他单负链病毒目RNA病毒的有效治疗和预防措施。

供稿 | 娄鑫垚

审稿 | 丛野

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 雨萱

微信号：FRCBS-THU

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原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06867-y

参考文献

参考文献

1. Li, Y. et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in children younger than 5 years in 2019: a systematic analysis. Lancet 399, 2047–2064 (2022).

2. Whelan, S. P., Barr, J. N. & Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 61–119 (2004).

3. Cressey, T. N. et al. Distinctive features of the respiratory syncytial virus priming loop compared to other non-segmented negative strand RNA viruses. PLoS Pathog. 18, e1010451 (2022).

4. Noton, S. L., Deflube, L. R., Tremaglio, C. Z. & Fearns, R. The respiratory syncytial virus polymerase has multiple RNA synthesis activities at the promoter. PLoS Pathog. 8, e1002980 (2012).

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